来源：雪球App，作者： 江苏耀海生物CDMO，（https://xueqiu.com/9950954021/297277341）
导读
菌种保藏是指保持微生物菌株活力和遗传性状的技术。微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退。菌种保藏的目的就是使菌株存活、不丢失、不污染杂菌、不发生或少发生变异，保持菌种原有的活性和各种特征。菌种保藏的基本原理是使微生物的生命活动处于半永久性的休眠状态，也就是将微生物的新陈代谢作用限制在最低范围内。
一、菌种保藏的原理
根据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以降低菌种的变异率。低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物的代谢作用，因此上述条件也是完成菌种保藏的重要手段。选择保藏方法时，首先应考虑方法能否长期地保持菌种原有的特性，同时也应兼顾到方法的经济和简便。在实际工作中，往往多种条件同时使用，以提高保藏效果。目前常用的保菌方法有：甘油保菌法、斜面保菌法、穿刺保菌法、液体石蜡覆盖保藏法、沙土保藏法、冷冻干燥法[1-3]。
二、菌种保藏步骤
常见的菌种保藏的一般步骤如下：（1）挑选特征典型的纯菌菌落；（2）确定保藏的合适菌体形态；（3）选择最适宜的保藏方法；（4）定期对保藏菌种进行检查，观察是否发生变化，若有变化，须改变保藏方法。保藏期满应及时进行移种[4]。
三、常见保藏方法
3.1
甘油保菌法
此方法适用于菌种的中长期保藏，是目前使用较为广泛的长期保藏法之一，操作简单、保藏期长，且菌种不容易发生变异。甘油保菌法适用于各类微生物，保藏时间可在1年以上。由于甘油本身十分粘稠，很难定量，因此一般将甘油和生理盐水按1:1的比例配成终浓度为50%的甘油溶液。使用时，按50%甘油：菌液=1:1的比例混合，使甘油终浓度在20-30%即可，甘油浓度过高或过低都不利于菌种保藏。将甘油菌种转移至-60~-80℃冰箱长期冻存。需要取用菌种的时候，将冻存管放在37℃水浴中快速解冻，直到菌种完全融化，此时可取出菌种进行实验，切勿常温融化。此外，应该注意不要对菌种进行反复冻融，避免死亡。
Tips：菌种是生产活动的起始原料，是一种重要的资源。菌种库需选择合适的保藏方法，并置于合适的环境，以维持菌种的特性稳定。耀海生物可以满足大肠杆菌的甘油管保藏（超低温冰箱或液氮）、以及冻干保藏的需求。
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图1 用甘油冻存菌种
3.2
斜面保菌法
斜面保藏是目前最普遍的短期保藏法，操作简单，使用方便，不需要额外的特殊设备，但需定期接种。因此工作量较大，而且传代次数多、易发生变异，且此方法污染杂菌的机会较高。因此，仅适用于短期经常使用的菌种。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后转移至4℃冰箱中保藏。保藏的时间根据微生物的种类而不同，一般大肠杆菌每一个月就需要移种一次，酵母菌则为2个月。需要取用菌种的时候，可用接种环在斜面上挑取少量菌体进行接种。在具体实验操作中，应该注意（1）斜面装液量以倾斜后不超过试管长度1/2为宜；（2）培养温度应较最适温度稍低，时间应较最适时间略长；（3）保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。
图2 斜面保藏菌种
表1 斜面保菌法的基本要求
3.3
穿刺保菌法
穿刺保菌法同斜面保菌法一样，均为常用的短期保藏方法，多用在传代培养中，因此也需要定期移种。具体操作为，准备一管半固体培养基，用接种针挑取菌种，自半固体培养基的中心垂直刺入，直至接近试管底部，但不要穿透，然后沿原穿刺线将接种针退出，于4℃冰箱保存即可。
3.4
液体石蜡覆盖保藏法
此方法是斜面保菌的辅助方法。具体为将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后注入无菌液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置在4℃冰箱中保藏。液体石蜡可防止因培养基水分蒸发而引起的菌种死亡，同时可以让菌体与空气隔绝，减弱菌种的代谢作用，延长保藏时间。需要取用菌种时，则用接种环从斜面上挑取少量菌种即可。此方法的优点是操作简单，不需要特殊的设备，且不需要频繁移种，保藏时间较长。缺点是保存时必须直立放置，占用空间较大。
表2 液体石蜡保藏对不同菌种的保藏效果
3.5
沙土保藏法
沙土保藏法是典型的载体保藏法，即将菌种吸附在载体沙子上然后进行干燥的保藏方法，其使用相当广泛。具体工艺步骤为，将培养好的菌种与无菌沙土混合，使菌体吸附在沙土载体上，干燥后转移至4℃冰箱保存。需要取用菌种的时候，取出少量沙土颗粒即可。大肠杆菌、酵母菌均可用此法保藏2年左右。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备，且保藏时间长。
3.6
冷冻干燥法
冷冻干燥法为先使微生物处在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压条件下利用升华现象除去水分，其中以真空冷冻干燥法最常见。菌种在升华的过程中水分被去除，细胞的生理活动趋于停止，从而使菌种长期维持存活的状态。需要取用菌种的时候，用无菌水或培养基重悬菌体，将菌悬液转移至固体培养基平板上进行培养。此方法适用于菌体的长期保存，但是相关的设备和操作相对其他几种保藏方法都比较复杂。
四、菌种保藏的影响因素
4.1
菌的质量
菌种是保藏中的关键影响因素。保藏的菌种应培养在营养丰富的条件下，使之进入稳定期，稍老一些的菌体对环境抵抗力强。另外，作为冷冻干燥的菌悬液细胞浓度要高，不同的菌对冷冻干燥的耐受程度不同，如果保存的菌液细胞浓度不高，就会使以后传种造成困难，保存期也会受到影响。
4.2
保护剂
不同种类的保护剂对不同菌种的作用不同，如个别菌种在脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达99.99%，而采用葡聚糖等混和保护剂时死亡率大大降低。一般情况下，不易保存的菌种对保护剂的要求较高。因此，选择好的保护剂是冷冻干燥保存菌种的关键因素。
4.3
其他理化因素
其他理化因素，诸如空气、温度、含水量对于菌种的保藏也是极为关键的。（1）空气：冷冻干燥后空气对细菌细胞影响较大，可导致细胞损伤进而死亡，故在冻干后应立即在真空下融封，才有利于长期保存；（2）温度：在干燥和真空状况下温度的影响并不大，因此可以在室温下保存，但许多微生物在4℃保存的存活率要比在室温下高1倍；（3）水分含量：水分含量过高对菌体存活不利，但完全脱水也不利于保存，一般把干燥后的细胞含水量控制在3%以下[5,6]。
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结语
今天，我们一起梳理学习了菌种保藏的原理、一般步骤，以及6种常见菌种保藏方法的注意事项和优缺点，且一并提到了菌种保藏的关键影响因素。
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